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HPLC高效液相色譜柱包含與支持材料鍵合的固定相（通常為多孔硅膠顆粒），以提供較大的表面積。固定相為樣本組分的分離提供了基礎。
樣本的物理化學特性、固定相化學組成、流動相組成、流速和色譜柱溫度決定了組分通過色譜柱的速率。研究人員可從各種固定相化學組成和色譜柱尺寸（如長度、內徑和支持粒徑）中進行選擇。
色譜柱類型 | 固定相 | 流動相 | 應用 |
反相 (RP) | 非極性，如 C18 或苯基 | 水和極性有機溶劑的混合物 | 占 HPLC 分離的大多數 |
正相 (NP) | 極性，如未結合硅膠 | 低極性有機溶劑的混合物 | 不溶于水的樣本和異構體 |
親水作用 (HILIC) | 極性，如硅膠或酰胺鍵合相 | 水和非極性有機溶劑的混合物 | 反相液相色譜分析對高極性樣品的保留較差 |
離子交換 (IEX) | 可離子化基團 | 通常為鹽加緩沖液的水溶液 | 可離子化樣本和大生物分子 |
離子對 | 非極性反相色譜柱 | 非極性條件加離子配對試劑 | 反相對酸或堿的保留較差 |
手性 | 手性基團，如多糖或環糊精 | 分析物和 SP 依賴物，可以是 RP、NP、極性有機物等 | 對映體（如外消旋藥物混合物）的分離/純化 |
疏水相互作用 (HIC) | 非極性，短烷基鏈或苯基 | 高鹽緩沖液梯度，非變性條件 | 蛋白質，通常為抗體 |
體積排阻 (SEC) | 惰性色譜柱，如右旋糖酐聚合物 | 與含水或有機流動相配合使用 | 大生物分子或合成聚合物 |
